«Обнаружение ферментов и изучение их действия на субстрат»

Наименование секции – Химия

Название работы: «Обнаружение ферментов и изучение их действия на субстрат»

ФИО автора – Астраханцев Александр Дмитриевич,

студент II курса

ГПОУ «Хилокское железнодорожное училище»

ФИО руководителя – Толстопятова Ирина Сергеевна,

преподаватель химии, биологии

Введение.

Объект исследования: клетки растительных и животных организмов.

Предмет исследования: ферменты в клетках растительных и животных организмов, их свойства.

Цель: выявить способы выделения ферментов из некоторых объектов, изучить их особенности и исследовать свойства.

Задачи: 1) охарактеризовать роль ферментов в организме и их применение.

2) рассмотреть строение молекул ферментов и особенности их работы.

3) выделить из объектов ферменты, исследовать их действие на субстрат, проанализировать влияние температуры на активность ферментов.

В живых клетках организма совершаются сотни процессов, происходящих с помощью ферментов - биокатализаторов. Поэтому ученые- биохимики, изучающие химические явления в живом организме, проявляют большой интерес к ферментам. Ферментами, или биологическими катализаторами, называются вещества белковой природы, вырабатываемые клетками животных и растений, ускоряющие течение отдельных химических реакций и обладающие специфичностью своего действия. Ферменты (от латинского fermentum- брожение, закваска) еще называют энзимами. К настоящему времени известны более двух тысяч ферментов, и их число продолжает расти. Так, известно, что одна единственная клетка простейшей бактерии использует в своей деятельности около тысячи разных ферментов.

Изучение химических реакций в живом организме показало, что разложение веществ, достаточно стойких в лабораторных условиях в живом организме идет довольно легко. Например, сахар и глюкоза легко расщепляются на углекислый газ, воду и другие продукты, белок - на более простые химические соединения- аминокислоты. Чтобы провести эти реакции в лаборатории, требуются или слабые реагенты, или высокая температура, значительно превышающая температуру живого организма. Так, глюкозу, чтобы она разложилась на углекислый газ и воду, нужно нагреть до температуры выше 200 С. Фермент, называемый лактозой, расщепляет за один час, такое количество молочного сахара- лактозы, которое в лабораторных условиях можно было бы разложить с помощью достаточно крепкого раствора соляной кислоты, в течение пяти недель. При этом требуется совершенно незначительное количество ферментов.

Если смешать в пробирке органические и неорганические вещества в тех же соотношениях, что и в живой клетке, но без ферментов, то почти никаких реакций с заметной скоростью идти не будет. То есть, только благодаря ферментам в клетках происходят химические реакции с большой скоростью и осуществляется обмен веществ.

Ферменты катализируют тысячи реакций, идущих в живой клетке - при дыхании, обмене веществ, размножении. И самое замечательное свойство ферментов – работают они чрезвычайно быстро. «Ферменты есть, так сказать, первый акт жизненной деятельности, - говорил академик И. П. Павлов, – все химические процессы направляются в теле именно этими веществами, они есть возбудители всех химических превращений. Все эти вещества играют важную роль, они обуславливают собой те процессы, благодаря которым проявляется жизнь, они и есть в полном смысле возбудители жизни. Они составляют основной пункт, центр тяжести физиологохимического знания».

Основная часть.

II. 1. Роль ферментов в организме.

Ферменты ускоряют жизненно важные химические реакции в клетках организмов. Установлено, что тот или иной фермент ускоряет только одну, какую - либо реакцию.

Уже во рту во время пережевывания пищи под влиянием фермента амилазы сложные сахара, в частности крахмал, начинают разлагаться на менее сложные. Крахмал под действием амилазы, слюны разлагается до мальтозы. При этом образуются еще и промежуточные продукты-декстрины, более простого строения, чем крахмал.

Пищеварительный фермент пепсин, содержащийся в желудке животных и человека, действуют только на белки, превращая их в более простое - пептон.

Пептон, попадая в тонкий кишечник, встречается с ферментом эрепсином, который доводит расщепление белков до их самых простых составных частей - аминокислот.

Жиры распадаются на свои составные части – высшие карбоновые кислоты и многоатомный спирт – глицерин, под действием фермента липазы, которой содержится в поджелудочной железе.

2. Применение биокатализаторов.

Изучение ферментов дает возможность управлять их действием. В настоящее время создана отрасль науки - техническая биохимия, занимающаяся производством, в основе которых лежат ферментативные процессы. Эти производства относятся главным образом к пищевой промышленности, таковы: хлебопечение, пивоварение, получение табака и чая, получение витаминов и другое.

Вскоре после того, как было уставлено действие пищеварительных ферментов, удалось выделить секрет поджелудочной железы свиньи, который в высушенном и измельченном виде стали применять при расстройстве пищеварения.

Уже в 1907 году у Отта Рема, владельца не большой фирмы, возникла гениальная идея. Известно, что содержащие белок пятна от пота, крови, яичного желтка или других пищевых остатков удаляется с белья с большим трудом. Рем предложил добавлять к обычному моющему средству порошок, полученный из поджелудочной железы свиньи. При замачивании сильно загрязненного белья в этом «ферментом» моющем средстве был получен удивительный эффект – пятна легко отмылись, так как протеазы поджелудочной железы расщепили белки на аминокислотные строительные «блоки». Так впервые было изготовлено моющее средство с биодобавками. Однако свое победное шествие моющие «биопорошки» начали лишь спустя 50 лет, когда взамен дорогого и не очень стабильного животного фермента удалось наладить массовое и дешевое микробиологическое производство подобных протеаз, в основном штаммов Bacillus. Эти Bacillus в отличие от большинства микробов предпочитают щелочную среду. И их протеазы лучше всего действуют в щелочных жидкостях, следовательно, они наиболее активны в мыльном растворе.

Сегодня около 80% всех выпускаемых моющих средств содержат протеазы. В 1980 году во всем мире было получено около 50 тонн бактериальных протеаз для биомоющих средств. При этом ферменты содержатся в моющих средствах буквально в «следовых» количествах: на один килограмм моющего средства приходится 0,1 грамм фермента. И даже при таких малых биодобавках сильно загрязненное белье становится чистым.

3. Строение ферментов.

Ферменты обычно имеют большую массу, чем субстраты. Такое несоответствие наводит на мысль, что не вся молекула фермента участвует в катализе. Чтобы разобраться в этом вопросе, необходимо разобраться со строением ферментов.

По строению ферменты могут быть простыми и сложными. Во втором случае в составе фермента кроме белковой части (апофермент) имеется группа небелковой природы - простетическая группа (ФАД, биотин), вместе они образуют активный холофермент. Простетические группы прочно связаны с ферментом. Ферментативную активность обеспечивают также коферменты, (НАД, НАДФ, кофермент А). Они непрочно связаны с ферментом. Белковая часть и небелковый компонент в отдельности лишены ферментативной активности, но, соединившись вместе, они приобретают характерные свойства фермента. Иногда активаторами ферментов выступают неорганические ионы. Например, для активации находящегося в слюне фермента амилазы необходимы ионы хлора

В белковой части ферментов содержатся уникальные по своей структуре активные центры, представляющие собой сочетание определенных аминокислотных остатков, строго ориентированных по отношению друг к другу, а также содержащие простетические группы, если таковые есть. Активный центр взаимодействует с молекулой субстрата с образованием фермент – субстратного комплекса, который затем распадается на фермент и продукт (продукты) реакции.

Согласно гипотезе, выдвинутой в 1890 году Э. Фишером, субстрат подходит к ферменту, как ключ к замку, т.е. пространственные конфигурации активного центра фермента и субстрата точно соответствуют «комплементарны» друг другу. Субстрат сравнивается с ключом, который подходит к «замку» - ферменту. Так активный центр лизоцима (фермента слюны) имеет вид щели и по форме точно соответствует фрагменту молекулы сложного углевода клеточной стенки бактериальной палочки, которая расщепляется под действием этого фермента.

В 1950 году Д. Кошланд предположил, что пространственное соответствие структуры субстрата и активного центра фермента создается лишь в момент их взаимодействия (гипотеза «руки и перчатки», или индуцированного взаимодействия). В настоящее время эта гипотеза «динамического узнавания» имеет большое число сторонников.

4. Механизм действия ферментов.

Ферменты действуют в живых организмах по тем же законам, что и любые катализаторы. Ферментативный катализ основан на снижении энергетического барьера (так называемой энергии активации) реакции за счет образования промежуточных комплексов фермента с субстратом. В отсутствие, например, амилазы реакция между крахмалом и водой не идет, потому что молекулы не обладают достаточной для этого энергии. Фермент ускоряет химический процесс, так как в его присутствии требуется меньше энергии для запуска данной реакции. Рассмотрим механизм действия ферментов подробнее.

Катализируя реакцию, фермент тесно сближает молекулу субстратов, так что те части молекул, которым предстоит прореагировать, оказываются рядом.

Субстрат, присоединившись к ферменту, несколько изменяется. Фермент может притягивать электроны, вследствие чего в некоторых связях молекулы субстрата возникает напряжение, связи между атомами ослабевают. Это повышает реакционную способность молекулы. Затем на поверхности фермента происходит катализируемая химическая реакция, после чего продукты реакции покидают фермент. Теперь фермент способен присоединить новые молекулы субстратов.

У ферментов есть некоторые особенности, которые их отличают от неорганических катализаторов:

1) они очень активны;

2) обладают строгой избирательностью. На каждую биохимическую реакцию действует строго определенный фермент или небольшая группа сходных ферментов;

3) действуют в небольших, определенных интервалах температур;

4) действуют в определенных значениях PH.

Практическая часть

Мы использовали некоторые способы выделения ферментов из некоторых объектов.

Опыт 1а: выделение инвертазы и изучение её действия на субстрат.

Оборудование и реактивы: штатив с пробирками, водяная баня, термометр, спиртовка, ступка с пестиком, пипетка, воронка с фильтром. Дрожжи прессованные, кварцевый песок, раствор гидроксида натрия, раствор сульфата меди (II) 5%-ный, вода дистиллированная, раствор сахарозы(10%-ный).

Краткое теоретическое пояснение: фермент инвертаза содержится в клетках большинства растений, но особенно много этого фермента в клетках прессованных дрожжей. Из этого объекта мы получили инвертазу.

Инструкция: 10г прессованных дрожжей поместили в фарфоровую ступку, добавили немного кварцевого песка и налили 5 мл воды. Смесь тщательно растирали. Затем прилили еще 15 мл воды, нагретой до 60 С, и растирали еще 2-3 минуты. Раствор отфильтровали. В полученном фильтрате находится фермент инвертаза.

С полученным фильтратом мы провели следующий опыт.

Опыт 1б: действие инвертазы на субстрат и влияние температуры на активность инвертазы.

Краткое теоретическое пояснение: под действием фермента инвертазы в клетках растений происходит гидролитическое расщепление сахарозы на глюкозу и фруктозу. Продукты гидролиза сахарозы можно обнаружить жидкостью Фелинга или качественной реакцией на глюкозу (взаимодействие с Cu(OH)2 ).

Инструкция:

1 мл фильтрата, полученного в опыте 1а - прокипятили.

В три пробирки налили по 10 мл 10%-ного раствора сахарозы:

Пробирка №1- контроль;

Пробирка №2- добавили 1 мл инвертазы;

Пробирка №3- добавили 1 мл прокипяченной инвертазы.

3) Все три пробирки поместили в водяную баню с температурой примерно

40о. Через 15 минут содержимое всех трех пробирок испытали на присутствие глюкозы (моносахарида). Для этого в эти пробирки прилили по 1 мл раствора сульфата меди (II), затем при взбалтывании прибавили несколько мл раствора гидроксида натрия (щелочь должна быть в избытке). Во всех трех пробирках образовался раствор светло- синего цвета. Теперь все три пробирки с растворами нагрели. Наблюдали, что в пробирке №2- происходит изменение цвета раствора с синего на желтый, а затем оранжевый. Это образовался осадок оксида меди(I)

Выводы: в пробирке №1- не было инвертазы, и при температуре 40 гидролиз сахарозы не произошел. Сахароза не образует в Cu (OH) 2– оранжево- красного осадка оксида меди (I).

В пробирке №2- произошло гидролитическое расщепление сахарозы на глюкозу и фруктозу. Глюкоза дает качественную реакцию с гидроксидом меди (II) c образованием оранжево- красного осадка оксида меди(I).

В пробирке №3- красного осадка оксида меди(I) не образовалось. Хотя в ней находились сахароза и инвертаза, потому что инвертаза была прокипяченная. Фермент инвертаза при кипячении потерял свою активность. Оптимальная температура для действия фермента- до 40о.

Опыт 2: получение амилазы слюны и её свойства.

Оборудование и материалы: воронка стеклянная, пипетка, водяная баня, сосуд со льдом, вата, колбочки, стаканы, пластинки стеклянные, термометр. Раствор крахмального клейстера, 1- процентный раствор йода в йодистом калии, 1- процентный раствор медного купороса, 10- процентный раствор едкого натра.

Краткое теоретическое пояснение: амилаза, содержащаяся в слюне, относится к группе ферментов гидролаз. Амилаза способна расщеплять полисахарид- крахмал до декстринов (веществ с меньшей молекулярной массой), затем до дисахарида мальтозы и, наконец, глюкозы. Протекание данного процесса гидролиза крахмала можно проследить по изменению окраски крахмала с йодом. Крахмал дает синее окрашивание с йодом. С течением времени, при прохождении гидролиза, окраска изменяется на красно- бурую. Это доказывает, что крахмал гидролизуется при действии ферментов.

Инструкция:

А) Приготовление амилазы слюны: ополаскиваем 2- 3 раза рот, чтобы удалить остатки пищи. Затем ополаскиваем рот с помощью дистиллированной воды, выливаем жидкость в другой стакан и фильтруем ее через вату. Амилаза находится в фильтрате.

Б) гидролиз крахмала под действием амилазы слюны: в две пробирки налили по 5 мл крахмального клейстера и в одну из них 5 мл воды, а в другую 5 мл раствора слюны. Обе пробирки одновременно поместили в водяную баню, температура в которой поддерживается приблизительно при 40 . в каждую пробирку поместили стеклянную палочку. Через несколько секунд наблюдаем уменьшение опалесценции жидкости в пробирке со слюной, вследствие образования растворимого крахмала. Наблюдение за ходом гидролиза осуществляется с помощью йодной реакции. Для этого наносим на стеклянную пластинку, положенную на лист белой бумаги, несколько капель раствора йода в йодистом калии и смешиваем их с каплями гидролизуемой смеси из пробирок, где идет гидролиз. По мере расщепления крахмала окраска меняется от синего до желтого (цвет раствора йода). Через 1 минуту с момента нагревания пробирок в водяной бане от каждой смеси отбираем с помощью стеклянной палочки по капле жидкости и смешиваем ее с каплей раствора йода на стекле. Повторяем подобное исследование действия фермента через 2, 4, 6, 8 минут. Окраска с йодом проб жидкости из пробирки со слюной меняется от синего к сине- фиолетовой, фиолетовой, буро- красной, красной и, наконец, она остается желтой, т. е. сохраняется цвет йода. Изменение окраски крахмала с йодом свидетельствует об образовании из крахмала декстринов с разной величиной молекул. После этого к оставшейся жидкости в опытной пробирке добавляем 1- 2 мл раствора сульфата меди и гидроксида натрия - появляется сначала желтый, а при более длительном нагревании - оранжево- красный осадок оксида меди(I) т. к. крахмал при действии фермента амилазы подвергается гидролизу с образованием глюкозы.

Жидкость в контрольной пробирке (вода) не изменяется при стоянии в водяной бане: пробы ее по-прежнему дают сине окрашивание с йодом и не образуется оксид меди (I).

В) Влияние температуры на активность амилазы слюны. В три пробирки №1, №2 и №3 наливаем по 5 мл разбавленной слюны. Пробирку №1 помещаем в сосуд со льдом, пробирку №2 оставляем при комнатной температуре, а пробирку №3 нагреваем в пламене спиртовки, чтобы инактивировать фермент действием высокой температуры. Раствор слюны кипит толчками и пенится, но нужно, чтобы и пена, если она образуется, прогрелась; амилаза слюны довольно устойчива к повышению температуры, поэтому кипячение продолжают 2- 3 минуты. Прокипяченной слюне даем остыть до комнатной температуры.

Во все пробирки со слюной наливаем по 5 мл раствора крахмала, в пробирку

№1 наливаем предварительно охлажденный во льду раствор крахмала. Пробирки №2 и №3 помещаем в водяную баню, температура воды в которой поддерживается около 40 С, а пробирку №1 оставляем в сосуде со льдом. В каждую пробирку помещаем стеклянную палочку. С помощью стеклянных палочек, по возможности одновременно, берем пробы из пробирок №1, №2, №3 и сливаем их с каплями йода в йодистом калии, нанесенными на стеклянной пластинке. Отмечаем окраску с йодом проб жидкостей из каждой пробирки. Продолжаем проводить гидролиз до тех пор, пока жидкость, из какой- либо пробирки не будет изменять желтой окраски йода, что свидетельствует об окончании гидролиза крахмала в данной пробирке.

Вывод: в пробирке №1- жидкость не изменила окраску при действии раствора йода, т. е. все время при взятии проб окраска была синей. Значит, при температуре 0 фермент амилаза не действует на крахмал и гидролиза не происходит. В пробирке №2- жидкость в течение времени проведения опыта изменила свою окраску при действии раствора йода, от синей до красно- желтой. Значит, при оптимальной температуре 40 амилаза слюны работает, и гидролизует крахмал. В пробирке №3 - жидкость не изменила окраску при действии раствора йода, она осталась синей. Значит, гидролиз не произошел, потому что амилаза слюны была прокипяченной. Это доказывает то, что фермент амилаза при кипячении потерял активность, и не действует на субстрат- крахмал.

Опыт 3: выделение каталазы и её действие на пероксид водорода.

Оборудование и реактивы: штатив для пробирок, марля, колба, терка, пипетка, пробирки. Клубень картофеля, 3- процентный раствор пероксида водорода.

Краткое теоретическое пояснение: каталаза относится к группе окислительно-восстановительных ферментов. Это двухкомпонентный фермент, активной группой которого является гемин. Каталаза разлагает пероксид водорода на воду и молекулярный кислород. Пероксид водорода, как известно, образуется в клетках растений под действием аэробных дегидрогеназ. В большом количестве он вреден для растения. Каталаза, разлагая часть пероксида водорода, устраняет его губительное действие на клетку.

Инструкция: очищенный картофель натираем на терке, и сок отжимаем через марлю в колбу. В пробирку приливаем слабый раствор пероксида водорода (на 5 мл воды 10 капель 3-процентного раствора пероксида водорода). Затем, в нее же вносим несколько капель сока клубне картофеля. Наблюдаем вспенивание вследствие выделения кислорода.

Вывод: в соке клубне картофеля содержится каталаза, которая очень быстро разлагает пероксид водорода с образованием кислорода.

Заключение.

Ферменты- ключи жизни. Ими обладают все существа - от самых простейших и мельчайших до человека. Они есть в растениях, и не будь их - не было бы фотосинтеза. Вот почему академик Н.Д. Зелинский говорил, что ферменты перебрасывают мост между живым и неживым, помогают создавать живое, органическое тело. Кроме Н.Д. Зелинского изучением ферментов занимались такие ученые как К.С. Кирхгоф, И.П. Павлов, С.Е. Северин, В.А. Энгельгард, Э. Фишер, Дж. Нортрон и другие. Ферменты можно получить в свободном состоянии (вне организма) и проводить с ними целый ряд реакций в лаборатории. Это помогает изучать сложные процессы, лежащие в основе жизненных явлений.

Мы выделили из объектов некоторые ферменты: из прессованных дрожжей выделили инвертазу, из сока клубня картофеля - каталазу, обнаружили в слюне амилазу. При проведении практических опытов мы пронаблюдали, как действуют эти ферменты на субстраты, они действительно действуют избирательно: инвертаза гидролизует сахарозу, амилаза гидролизует крахмал. Температура- это один из факторов, от, которого зависит активность ферментов. При выполнении практических опытов, мы выявили, что ферменты действуют при оптимальной температуре, при низкой температуре его активность снижается, при высокой температуре (если фермент подвергнуть действию высоких температур) он теряет активность.

лянее же вносим несколько капель сока клубне карто (на 5 мл воды 10 капель 3егидрогеназ. сой). 0000000000000000Используемая литература.

Васильева Е.М., Горбунова Т.В. эксперимент по физиологии растений в средней школе. Москва «просвещение» 1978.

Калинин И.А. «Катализ», Государственное издательство технико-теоретической литературы. Москва, 1955.

Ляпунов Б. «Химия завтра» Издательство «Детская литература» Москва, 1967.

Смолин А.Н., Рождественский В.А. «практическая работа по органической

и биологической химии». Издательство «Просвещение» Москва, 1955.

5) Шульгин Г.Б. «эта увлекательная химия» Москва, издательство «Химия»,

1984.

Энциклопедический словарь юного химика (составители: Крицман В.А., Станцо В.В.) второе издание, 1990.

«Химия в школе» №1, 2005.

Лабораторный практикум по курсу «Общая биология» в средних проф. училищах. Методическая рекомендация.