Учебно-исследовательская работа «Биоиндикация общей токсичности материалов на основе пекарских дрожжей»

Муниципальное бюджетное общеобразовательное учреждение

«Кингисеппская средняя школа № 2»

Проект

ТЕМА УЧЕБНО-ИССЛЕДОВАТЕЛЬСКОЙ РАБОТЫ:

Биоиндикация общей токсичности материалов на основе пекарских дрожжей

Выполнила:

ученица 11а класса Гришина Дарья

Научный руководитель:

Гришина Т.А, учитель биологии

МБОУ «КСОШ №2»

СОДЕРЖАНИЕ

Введение…………….………………………………………………….…2

Актуальность……………………………………………………….…2

Проблема………………………………………………………….…...2

Гипотеза……………………………………………………………..…2

Цель …………………………………………………………………....3

Задачи………………………………………………………………..…3

Обзор литературы……………………………………………..……….…...3

Особенности природных материалов для подстилок…….……….....3

Особенности дрожжей как биоиндикаторов…………...…………….4

III. Материалы и методы …..………….…………………………….………..…...6

Ознакомление с методиками………………….......................................6

2. Материалы……………………………………………………………….7

3. Описание эксперимента………………………………………….……..7

4. Анализ результатов ……………………………………………………..8

5. Общий вывод ………………………………………………………….…9

IV. Заключение……………………………………………………………………...9

V. Список используемых источников информации……………………………..11

VI. Приложения…………………………………………………………….…........11

Введение

Актуальность

Среди методов биотестирования абиотических факторов среды, в настоящее время особо выделяют экспрессметоды. Классические длительные эксперименты в быту почти не возможны по ряду причин. Одним из самых распространенных объектов исследования в области биотестирования являются дрожжи: они сочетают преимущества прокариотических моделей (скорость роста колоний, меньшая сложность генетической модификации) и эукариотических организмов, изучение которых позволяет экстраполировать полученные данные для организма млекопитающих и человека. Доступность такого варианта проверки материалов дает возможность проводить биотестирование как на производстве для предварительной оценки ситуации, так и в домашних условиях.

Проблема

В настоящее время идет активный поиск биотестов. Дрожжи могут быть использованы в качестве биотеста. Для использования дрожжей разработаны различные тест-системы, однако область их применения, как правило, ограничивается лабораторными условиями. В быту возникает необходимость проверить общую токсичность для товаров, на которых отсутствует соответствующая маркировка. В частности мы столкнулись с ситуацией отсутствия указания класса опасности на упаковке подстилочного материала – хвойные опилки, предназначенные для мелких животных.

Гипотеза

Предположила, что, получив вытяжку растворимых веществ из хвойных опилок, можно определить их общую токсичность, используя в качестве биотеста пекарские дрожжи в бытовых условиях.

Цель

Проверить возможность использования в качестве биотеста пекарских дрожжей в бытовых условиях на примере тестирования общей токсичности хвойных опилок.

Задачи

Изучить литературу

Провести эксперимент по определению общей токсичности хвойных опилок

Провести анализ результатов

Обзор литературы

Особенности природных материалов для подстилок

Назначение подстилки — препятствовать отдаче тепла животного полу, поглощать влагу и создавать сухое и мягкое ложе. Из подстилочных материалов выбирают такие, которые обладают малой теплопроводностью, боль­шой теплоемкостью, влагопроницаемостью, гигроскопичностью, газопо­глотительными свойствами. Вместе с тем подстилка не должна приставать к волосяному покрову животных, содержать вредные и ядовитые вещества, не быть пораженной плесневыми грибами, не пылить. Важно, чтобы подстилочный материал после его использования не терял ценность как удобрение. Лучшим подстилочным материалом считается солома. Солома, бесспорно, самая теплая, мягкая и легко пропускает влагу. Ее легко достать, хотя в дождливые годы она может стать дефицитом. Еще одно преимущество соломы состоит в том, что от нее легче избавиться, чем от некоторых других видов подстилки: ее можно сжечь или использовать в качестве компоста. Основной недостаток соломы в том, что в ней может быть много пыли или грибных спор, вызывающих аллергию, приводящую к респираторным заболеваниям. После соломы наиболее популярными являются древесные опилки. При правильном обращении они обеспечивают чистоту и гигиену, их не едят. В опилках нет спор плесневых грибов, нет пыли, они являются хорошей подстилкой для животных и их хозяев с любыми видами респираторных заболеваний. Однако у опилок тоже есть свои недостатки. Много весят при намокании и долго сохнут. Опилки могут содержать химикаты, которыми обрабатывали деревья, и это может вызвать у животных раздражение кожи или заболевания глаз, когтей. В отличие от соломы, в которой содержится воздух, опилки быстро спрессовываются. Поэтому подстилка из опилок не такая теплая, как соломенная, и на ней менее приятно лежать, кроме того, опилки подвижны, поэтому животное может оказаться на голом полу.

Измельченная бумага почти свободна от пыли, поэтому часто применяется при содержании животных, страдающих от аллергии к соломе или респираторных заболеваний. Бумага дешевле опилок, но, с другой стороны, она быстрее загрязняется, чем опилки или солома. Хорошо то, что она мало весит и отлично сохраняет тепло. Однако часто она изготавливается из печатных изданий и может оставлять пятна на шерсти, особенно светлой окраски. Красители, используемые в типографской печати, являются токсичными. Норма потребления этого вида подстилки больше, чем опилок.

Торфяной мох можно использовать для подстилки в тех местах, где его легко достать. Обычно он продается в пластиковых мешках. У него тоже есть свои сильные и слабые стороны. Он достаточно мягок, несъедобен, от него сравнительно легко избавляться. Но, всё же, основное преимущество мха перед другими подстилками в безопасности: он не вспыхивает, как спичка, при пожаре. С другой стороны, он дорог, много весит, быстро промокает и слеживается, если его часто не перетряхивать и не убирать, к тому же он темного цвета, поэтому трудно определить мокрые места. К положительным сторонам этой подстилки можно отнести бактерицидные свойства сфагнового мха.

Особенности дрожжей как биоиндикаторов

Выявление класса опасности веществ основывается не только на количественных расчетах по химическому составу содержащихся компонентов, но и на экспериментальной биологической проверке. Экспериментальное определение класса опасности по сути своей заключается в лабораторном исследовании экологической токсичности анализируемых образцов с использованием биологических объектов. Оценка токсичности отходов проводится:

а) при необходимости подтвердить отсутствие токсичности при установлении расчетным методом V класс опасности пробы;

б) если невозможно определить качественный и количественный состав отходов и определить класс опасности расчетным методом;

в) по желанию заинтересованной стороны или при необходимости уточнить полученный расчетным методом класс опасности отходов.

Процедура биотестирования предполагает анализ водной вытяжки на острую токсичность, т.е. относительной кратковременный эксперимент (от нескольких минут до 4 сут.) не менее, чем в 2 тест-системах, основанных на использовании видов из разных биологических таксонов, например, ракообразные и простейшие, водоросли и бактерии и т.п. Класс опасности устанавливается по разведению водной вытяжки, при которой не выявлено вредного воздействия на биологические объекты. Отнесение отходов к V классу опасности основано на действии водной вытяжки отхода без ее разведения, для определения других классов опасности оценивается воздействие раствора с соответствующей кратностью разведения

Дрожжи давно используются как биотесты. Они сочетают преимущества прокариотических организмов (высокая скорость роста) и эукариотических организмов, изучение которых позволяет переносить полученные данные на другие систематические группы эукариотических организмов [1]. Для использования дрожжей разработаны различные тест-системы [3], область применения которых - это фармакология и биотестирование различных химических соединений. Существуют методики, основанные на определении интенсивности пенообразования в дрожжевой суспензии с глюкозой. В качестве тест-объекта используются дрожжи Saccharomyces cerevisiae. Известно, что дрожжи этой расы в конце брожения всплывают на поверхность, процесс сопровождается интенсивным образованием пены. Такая особенность верховых дрожжей используется в качестве тест-отклика, показывающего эффекты действия токсических веществ на физиологическую активность дрожжей [2]. Дрожжи Saccharomycescerevisiae служат удобной эукариотической моделью для определения токсичности различных тяжелых металлов. Большинство биотестов с применением дрожжей основаны на определении цитотоксического или генотоксического действия тяжелых металлов, т. е. металлов, стоящих таблице Менделеева за элементом «железо». Дрожжи очень чувствительны к внешним воздействиям. Под влиянием различных факторов они существенно меняют свой биохимизм, осуществляемый с участием соответствующих ферментов. Исследования ученых показали, что используемые в хлебопекарной промышленности дрожжи можно эффективно применять в качестве тест-объекта для оценки качества воды, в которой находятся различные примеси. Можно выявить те или иные примеси (экотоксиканты), превышающих ПДК. В этом случае происходит снижение бродильной энергии дрожжей. Учитывая способность дрожжей изменять биохимическую активность при действии различных факторов среды, их использования в качестве тест-объекта для оценки действия стимулирующих, оздоровляющих экологическую обстановку факторов. Можно проверить влияние через водную среду биостимуляторов на почвенных обитателей. 

III Материалы и методы

Ознакомление с методиками

Токсичность исследуемых материалов можно оценивать по изменению пенообразующей активности S. cerevisiae [4]. Для этого в 20 мл раствора исследуемой вытяжки вносят 1,36 г сухих дрожжей, тщательно перемешивают и добавляют 0,4 г глюкозы. Приготовленную смесь разливали по 3 мл в мерные пробирки объемом 10 мл, выдерживают в течение 15 мин при +20 ºС, затем определяют объем образовавшейся пены. Контролем служит суспензия дрожжей с глюкозой без внесения вытяжки. Все эксперименты проводят не менее чем в 5 независимых опытах с 3-6 параллельными измерениями в каждом. Для статистической обработки полученных данных желательно использовать программу Microsoft Exсel. Выводы делают с вероятностью прогноза Р ≥ 0,95. Достоверность различия результатов определяют с помощью критерия Стьюдента.

Для приготовления водной вытяжки из материала взвешивают 100-120 г пробы в воздушно-сухом состоянии. Масса пробы на стадии перед приготовлением водной вытяжки должна быть достаточной для получения необходимого объема экстракта при проведении биотестирования во всех предполагаемых разведениях с учетом контрольных испытаний. Навеску почвы помещают в колбу вместимостью 1000 см3 и приливают 4-кратное количество культивационной воды. Далее встряхивают, после чего отстаивают в течение 30 мин. Надосадочную жидкость сливают, а затем профильтровывают через бумажные обеззоленные фильтры. Фильтры предварительно промывают дистиллированной водой. Бумажный фильтр помещают в воронку и получают фильтрат, с которым дальше работают.

Другой способ определения токсичности на наличии тяжелых металлов может быть проведен с использованием растения кресс-салат.

Кресс-салат - однолетнее овощное растение, обладающее повышенной чувствительностью к загрязнениям почвы тяжелыми металлами, а также к загрязнению воздуха газообразными выбросами автотранспорта. Этот биоиндикатор отличается быстрым прорастанием семян и почти стопроцентной всхожестью, которая заметно уменьшается в присутствии загрязнителей. Кроме того, побеги и корни этого растения под действием загрязнителей подвергаются заметным морфологическим изменениям (задержка роста и искривление побегов, уменьшение длины и массы корней, а также числа и массы семян). Кресс-салат как биоиндикатор удобен еще и тем, что действие стрессоров можно изучать одновременно на большом числе растений при небольшой площади рабочего места .
Семена кресс-салата проращивают в чашках Петри по 50 семян на фильтрованной бумаге или на исследуемой почве в течение 10 дней. Контролем служат семена, проращиваемые в чистом воздухе и на незагрязненной почве. Растения можно высаживать и в открытый грунт. При наличии загрязняющих веществ снижается всхожесть и рост зародышевых корешков. В открытом грунте под влиянием газообразных выбросов снижается общая длина проростков.
Привлекательны также и весьма короткие сроки эксперимента. Семена кресс-салата прорастают уже на третий-четвертый день, и на большинство вопросов эксперимента можно получить ответ в течение 10-15 суток.

Материалы

Для эксперимента использованы:

Дрожжи пекарские, 5 г 1 упаковка

Мука пшеничная, 1 кг 1 упаковка

Опилки сосновые, 2 кг 1 упаковка

Вода водопроводная

Лабораторная посуда

Описание эксперимента

Для проверки гипотезы использовали метод эксперимента и наблюдения. Для визуализации происходящих процессов был использован кулинарный прием приготовления «дрожжевого теста» на основе пшеничной муки. Из исследуемых опилок была получена водная вытяжка. Вытяжку готовили из расчета 200 г опилок на 1 литр воды. Использовали водопроводную, отстоянную в течение суток воду. Это стандартный прием удаления хлора. В течение 30 минут воду и опилки перемешивали, затем следующие 30 минут смесь отстаивалась. Верхний слой отстоявшегося экстракта (вытяжки) слили и профильтровали через бумажный фильтр. Полученную вытяжку использовали для определения наличия или отсутствия токсических, водорастворимых веществ в составе опилок. Для приготовления теста использовали половину количества дрожжей из упаковки, 50мл водной вытяжки и 50 г муки. Тщательно перемешали и разделили на три равные порции. На трубе центрального отопления сделали термокамеру с температурой +25 градусов Цельсия. Контролем служило тесто, замешанное в тех же пропорциях на отстоянной водопроводной воде. Также проделали третий опыт для наглядности действия: сделали тесто в тех же пропорциях на основе раствора с обычным кухонным порошком. Порошок подавлял действия дрожжей, что и доказывает, что биотестирование с помощью пекарских дрожжей возможно. Наблюдали скорость подъема теста и фиксировали высоту через каждые 15 минут (рис. 1,2,3). Данные оформили в виде таблицы (табл.1).

Анализ результатов

В результате проведенных опытов было установлено, что в исследуемых опилках опасных веществ не обнаружено. На упаковке опилок не было никакой информации об уровне опасности. Хоть они оказались и безопасны, информация об отсутствии опасности должна быть написана на упаковке. Третий опыт дает нам право утверждать, что биотестирование с помощью пекарских дрожжей возможно. Порошок в составе теста практически полностью подавил действие дрожжей, значит, они способны реагировать на изменение состава материала.

Общий вывод

Дрожжи уже давно признаны эффективным способом оценки качества материалов. Это еще раз было доказано на примере хвойных опилок. Им можно присудить пятый уровень опасности, т.е. данные опилки не опасны как для крупных животных, так и для мелких грызунов. Любой человек может в бытовых условиях совершить данный опыт. Дрожжи – универсальное средство для определения токсичности материалов, ведь данное биотестирование могут проводить как большие компании для контроля качества своей продукции, так и обычные люди дома. Вся нужная литература была изучена для сравнения видов природных материалов для подстилок домашних животных. Древесные опилки признаны самыми универсальными.

IV Заключение

В настоящее время в прикладной экологии все большее внимание уделяется биологическим методам контроля. Биологические объекты – это уже готовые лаборатории, созданные и проверенные природой. Остается научиться ими пользоваться. Экотоксичность (экологическая токсичность) - это способность веществ вызывать неблагоприятные воздействия на жизнь биологических компонентов экосистем. Это явление сопровождает нас в современной жизни и вызывает тревогу. Показателем токсического действия служит степень изменения определенных параметров живых объектов, которая фиксируется различными методами.

Для создания максимально благоприятных и комфортных условий жизни домашних животных необходимо нести ответственность за все наши действия. Мы решаем за них, что лучше, а это значит, что «мы в ответе за тех, кого приручили». Нам нужен простой и достоверный способ проверить материалы для своих любимцев и для себя. В работе был предложен один из способов проверки качества материалов в домашних условиях. Любой желающий может им воспользоваться.

V. Список используемых источников информации

1. Биоиндикация и биомониторинг / отв. ред. Д. А. Криволуцкий. – М.: Наука, 1993. – 120 с.

2. Евгеньев М. И. Тест-методыи экология. // Соросовский образ. журнал, 1999, т. 5, № 11, с.29–34.

3. Ефременко В. И., Столбин С. В., Греков Л. И. Биосенсоры и аспекты их использования. // Прикл. биохимия и микробиол, 1990, т. 26, с. 11–18.

4. Прикладная экобиотехнология : учебное пособие : в 2 т. Т. 2 / А. Е. Кузнецов [и др.]. — 2-е изд. — М. : БИНОМ. Лаборатория знаний, 2012. — 485 с. : ил., [4] с. цв. вкл.

5. http://window.edu.ru/catalog/pdf2txt/889/77889/58856?p_page=22

Приложения

Рисунок 1

Рисунок 2

Рисунок 3

Таблица 1. Результаты эксперимента

Таблица 2.