«Исследование бактерий Azotobacter, выделенных из городской почвы, на жизнестойкость при введении в минерализованную почву»

Муниципальное бюджетное общеобразовательное учреждение

«Средняя общеобразовательная школа №10 имени Заслуженного учителя Российской Федерации С.Н. Шепелева» города Лиски Воронежской области

ИДИВИДУАЛЬНЫЙ ПРОЕКТ

Тема: «Исследование бактерий Azotobacter, выделенных из городской почвы, на жизнестойкость при введении в минерализованную почву»

Предметная область: Химия

Выполнила: Дорожкина Виктория

Руководитель: Маскевич Анна Витальевна

учитель химии МБОУ «СОШ №10»

Лиски, 2022

Введение

Микроорганизмы важны в многочисленных отраслях, помимо окружающей среды микроорганизмы обитают и в нашем организме, они участвуют в метаболизме, синтезируют важные для нас витамины, а также влияют на работу многих систем органов. Их повсеместное распространение и быстрое размножение, а также появление новых штаммов, требует их тщательного изучения. Широкое распространение микроорганизмов свидетельствует об их огромной роли в природе. При их участии происходит разложение различных органических веществ в почве и водоёмах, они обуславливают круговорот веществ и энергии в природе, от их деятельности зависит плодородие почв, формирование каменного угля, нефти, и многих других полезных ископаемых. От них зависит обогащение почв азотом, борьба с вредителями сельскохозяйственных культур, правильное приготовление и хранение кормов, создание кормового белка, антибиотиков и т.д

Актуальность: Выделение почвенных штаммов очень важно в современном мире. Азотобактер применяют в медицине, пищевой промышленности и биосорбции тяжёлых металлов.

Научная новизна работы: Участие в рамках проекта «Всероссийском атлас почвенных микроорганизмов», даёт нам возможность стать соавторами создания всероссийского атласа почвенных микроорганизмов. Выявление биоразнообразия штаммов Azotobacterа, выделенных из различных типов почв г.Лиски Воронежской области на основе физических и биохимических характеристик.

Цель: Исследование бактерий Azotobacter, выделенных из почвы г. Лиски, подверженных техногенным воздействиям, на жизнестойкость при введении в минерализованную почву.

Задачи:    

1.Подготовка почвенных образцов, отобранных в различных районов г. Лиски Воронежской области.

2.Исследование механического состава почвы и наличие карбонатов.

3.Определение кислотности среды почвенной вытяжки.

4.Определение содержания нитратов в почве. 

5.Изучение почвенного дыхания.

6.Посев и наблюдения за ростом колоний бактерий Azotobacter.

7. Микроскопическое исследование образца.

8. Исследование бактерий Azotobacter, выделенных из городской почвы, на жизнестойкость при введении в минерализованную почву»

Объект исследование: образцы почв г. Лиски.

Предмет исследования: бактерии Azotobacter

Методы: методичка “Охотники за микробами”

Гипотеза: бактерии азотобактера, подверженные техногенным воздействиям, имеют высокую жизнестойкость в минерализованной почве (различные факторы).

Предполагаемый результат: создание электронной базы образцов почв г. Лиски и образцов колоний бактерий Azotobacter, в рамках проекта «Всероссийский атлас почвенных микроорганизмов».

1.Теоретическая часть 1.1 История открытия азотобактера

В 1901 году Бейеринк выделил из почвы аэробную неспорообразующую грамотрицательную бактерию, фиксирующую молекулярный азот, и назвал ее Azotobacter chroococcum (в родовом названии отражена способность бактерии фиксировать азот, в видовом - способность синтезировать коричневый пигмент - chroo и образовывать кокковидные клетки - coccum). Азотобактер - типичный представитель свободноживущих микроорганизмов. Свободноживущие - это все те микроорганизмы, которые живут в почве независимо от того, развивается вблизи растение или нет.

Культуры азотобактера в лабораторных условиях отличаются полиморфизмом. Молодые клетки азотобактера подвижны; они имеют многочисленные или единичные жгутики. У азотобактера обнаружены выросты, подобные фимбриям. В старых культурах клетки азотобактера покрываются плотной оболочкой, образуя цисты. Они могут прорастать, давая начало молодым клеткам.

Полиморфизм азотобактера зависит в значительной степени от состава среды, на которой он выращивается. На среде с этиловым спиртом (в качестве единственного источника углерода) азотобактер длительное время сохраняет подвижность и форму палочек. В то же время на многих других средах полиморфизм проявляется очень резко.

На плотных питательных средах, не содержащих азота, азотобактер образует крупные слизистые, иногда морщинистые колонии (рис. 176), окрашивающиеся при старении в желтовато-зеленоватый, розовый или коричнево-черный цвет. Колониям разных видов азотобактера присуща своя специфическая пигментация.

К настоящему времени известен ряд видов азотобактера: Azotobacter chroococcum, Az. beijerinckii, Az. vinelandii, Az. agilis, Az. nigricans, Az. galophilum.

Источником азота для азотобактера могут служить разнообразные минеральные (соли аммония, азотной и азотистой кислот) и органические (мочевина, различные аминокислоты) соединения. Однако если азотобактер развивается только за счет связанного в среде азота, он не выполняет своей основной функции - фиксации молекулярного азота. Азотобактер обычно фиксирует до 10-15 мг молекулярного азота на 1 г использованного источника углерода (например, глюкозы, сахарозы). Эта величина сильно колеблется в зависимости от условий выращивания культуры, состава питательной среды, ее кислотности, температуры, аэрации.

По отношению к источникам углерода В. Л. Омелянский (1923) назвал азотобактер полифагом («всеядным»). Азотобактер хорошо усваивает разнообразные углеводы (моно- и дисахара, некоторые полисахариды), органические кислоты, многоатомные спирты (глицерин, маннит) и другие вещества. Многим исследователям удавалось выращивать азотобактер в чашках с питательной средой без азота и углерода, если чашки были помещены в камеру, где находились пары ацетона, этилового спирта или некоторых других органических соединений. В присутствии легкодоступных форм углеродсодержащих соединений азотобактер может частично использовать углекислоту из атмосферы. Повышение концентрации углекислого газа до 0,5% в воздухе несколько стимулирует развитие азотобактера. Но азотобактером лучше усваиваются легкодоступные формы углеродсодержащих органических соединений. В почве запас подвижного органического вещества невелик, поэтому именно недостаток легкодоступных соединений углерода в первую очередь ограничивает развитие азотобактера в природных условиях.

Какие же органические соединения может использовать в почве азотобактер? Перегнойные вещества почвы азотобактером практически не усваиваются. Поэтому в почвах, даже очень богатых перегноем, при отсутствии свежих органических остатков интенсивного размножения азотобактера не происходит. Однако, если в почве имеются органические соединения и продукты распада растительных и животных клеток, азотобактер развивается хорошо. В частности, он усиленно размножается в почвах, удобренных соломой и соломистым навозом, а также в разнообразных компостах, содержащих целлюлозу. Азотобактер хорошо ассимилирует вещества, образующиеся при распаде целлюлозы. Развитие азотобактера и фиксация им азота в значительной степени зависят от наличия в среде фосфора. Источником фосфора могут служить как органические, так и минеральные фосфорсодержащие соединения. Высокая чувствительность азотобактера к фосфору позволила разработать микробиологический метод определения потребности почв в фосфорных удобрениях. В качестве тест-организма в этом методе используется азотобактер. Микробиологические методы определения потребности почвы в удобрении имеют ряд преимуществ перед химическими анализами, хотя, безусловно, уступают в точности.

Важную роль в обмене веществ азотобактера играет кальций. Этот элемент необходим азотобактеру при питании как молекулярным, так и аммонийным азотом (Г. Н. Зайцева, 1965). Недостаток кальция в среде приводит к сильной вакуолизации клеток и их вздутию. Высокая чувствительность азотобактера к кальцию, так же как и к фосфору, используется для определения потребности почв в известковании.

Микроэлементы (молибден, бор, ванадий, железо, марганец) необходимы азотобактеру в первую очередь для осуществления процесса азотфиксации. Потребность в микроэлементах определяется в значительной степени геохимическими условиями существования азотобактера в почвах. Штаммы микроорганизма, выделенные из почв с высоким естественным содержанием того или иного микроэлемента, нуждаются, как правило, в более высоких концентрациях этих элементов. Интересно, что радиоактивные элементы (радий, торий, уран) оказывают стимулирующий эффект на развитие азотобактера и процесс азотфиксации.

1.2 Азотобактер и реакция среды

Азотобактер чрезвычайно чувствителен к реакции среды. Оптимальная для его развития область рН 7,2-8,2. Однако азотобактер способен развиваться и на средах с рН от 4,5 до 9,0; кислая реакция среды неблагоприятно действует на его развитие. Из кислых почв выделяются неактивные формы азотобактера, утратившие способность связывать молекулярный азот.

Большое влияние на развитие азотобактера оказывает влажность почвы. Клетки азотобактера имеют меньшее осмотическое давление, чем клетки грибов и актиномицетов; потребность во влаге аналогична потребности высших растений. Азотобактер распространен в пресных водоемах, илах, затопляемых рисовых полях, сточных водах, сильно увлажненных почвах, на водных растениях в прудах и водохранилищах. Это свидетельствует о его высокой степени гидрофильности. На основании высокой потребности во влаге почвенных форм азотобактера предполагается, что предки некоторых морских и почвенных видов азотобактера могли быть общими. В отношении температуры азотобактер является типичным мезофильным организмом, с оптимумом развития около 25-30 °С. Понижение температуры азотобактер переносит хорошо, поэтому зимой даже в северных широтах численность его клеток в почве заметно не уменьшается.

Из биологических факторов, влияющих на развитие азотобактера, следует прежде всего отметить почвенные микроорганизмы. Они могут оказывать влияние на жизнедеятельность азотобактера в почве косвенно, изменяя, например, рН или окислительно-восстановительные условия, и непосредственно, вырабатывая питательные и биологически активные вещества. Так, активирующее влияние целлюлозоразрушающих и маслянокислых микроорганизмов на развитие азотобактера и его антагонистические отношения с представителями почвенной микрофлоры отмечали многие советские и зарубежные исследователи. Биоценоз микроорганизмов, формирующийся в условиях той или иной почвы, меняется в значительной степени под влиянием растительного покрова. И азотобактер как член биоценоза также зависит от этого фактора. С помощью метода радиоавтографии установлено, что при нанесении меченных по фосфору клеток азотобактера на семена зерновых культур клетки обычно концентрируются вокруг растущей корневой системы проростков.

Имеются, однако, данные, что клеток азотобактера в ризосфере растений очень мало. В самом лучшем случае (при полном отсутствии антагонистов благоприятных окружающих условиях) их количество не превышает 1% от общего числа ризосферной микрофлоры.

Культуры азотобактера, как правило, образуют значительное количество биологически активных веществ: витамины группы В, никотиновую и пантотеновую кислоты, биотин, гетероауксин и гиббереллин. Однако, несмотря на то, что культуры азотобактера вырабатывают целую серию биологически активных веществ, внесение витаминов, гиббереллина и гетероауксина в среду ускоряет рост азотобактера. Реакция на дополнительное внесение витаминов в среду является индивидуальной особенностью штаммов.

Азотобактер может продуцировать ростовые вещества типа ауксинов. Это подтверждается опытами, в которых было установлено образо вание дополнительных корешков у черенков фасоли под влиянием ауксинов, вырабатываемых азотобактером. Биологический тест - карликовая форма гороха сорта Пионер - позволяет определить в культуре азотобактера гиббереллиноподобные соединения.

Все эти соединения в совокупности способны стимулировать прорастание семян растений и ускорять их рост в тех, конечно, случаях, когда на корневой системе растений находится достаточное количество клеток азотобактера.

Кроме того, была обнаружена антагонистическая активность азотобактера по отношению к возбудителям бактериальных болезней растений. Азотобактер синтезирует фунгистатический (задерживающий развитие грибов) антибиотик группы анисомицина. Ряд грибных организмов, встречающихся на семенах и в почве (виды из родов Fusarium, Alternaria, Penicillium), может угнетать развитие многих видов растений, особенно в холодную погоду. Азотобактер, продуцируя противогрибные антибиотические вещества, помогает растениям расти и развиваться, что имеет особенно большое значение в ранние фазы развития.

К сожалению, способность азотобактера активно размножаться в почве и проявлять свои многогранные качества весьма ограничена из-за дефицита легкодоступных органических веществ в почве и высокой требовательности микроорганизма к окружающим условиям. Поэтому стимулирующий эффект азотобактера проявляется лишь на плодородных почвах.

Распространение азотобактера в почвах имеет определенные закономерности. В целинных подзолах и дерново-подзолистых почвах, характеризующихся кислой реакцией, условия для развития азотобактера неблагоприятны. Только окультуривание таких почв создает возможности для его развития. В почвах с повышенным увлажнением и преобладанием луговой растительности (почвы пойм) азотобактер обычно встречается в течение всего вегетационного периода в больших количествах. В торфяниках азотобактер или отсутствует, или развивается очень слабо. В зоне достаточно увлажненных северных мощных черноземов азотобактер развивается хорошо, а в зоне обычных и южных черноземов при отсутствии орошения, а также в целинных и неполивных окультуренных каштановых почвах только как весенний эфемер. Максимальное развитие азотобактера в весенний период наблюдается и в целинных и в богарных почвах сероземной зоны. В солонцах и солончаках распространены преимущественно солестойкие расы азотобактера. В основном в почвах нашей страны доминирует Az. chroococcum.

2. Практическая часть

Почвенный покров территории городского поселения город Лиски отличается многообразием. На территории, вследствие неоднородности условий почвообразования, среди черноземов типичных в виде полос и пятен встречаются интразональные почвы: солонцы, солоды, лугово-черноземные, пойменные, лугово-болотные, овражно-балочного комплекса, которые создают пестроту почвенного комплекса. Для исследования нами были сделаны заборы почв на разных участках г. Лиски, где почва подвержена разным степеням техногенным воздействиям. Приложение 1 Фото 1,2,3.

2.1. Опыт №1 «Определение механического состава почвы»

Механический состав почвы. Чтобы узнать, какая на участке почва, берем пригоршню земли, равномерно увлажняем ее, чтобы по консистенции она напоминала густую пасту, и скатываем «колбаску» толщиной около 3 мм. Затем смотрим на состояние почвы, определяем тип по таблице.

Результат: При исследовании механического состава почвы крупные песчаные зёрна не образовывались, при раскатывании образовалась длинный жгут, при сгибании которого образовались трещины.

Вывод: Исследование механического состава почвы показало, что образец является тяжелосуглинистом типом. Приложение 1 Фото 4.

2.2. Опыт №2 «Определяем наличие в почве карбонатов»

Наличие в почве карбонатов устанавливают с помощью 10%-ной соляной кислоты. Небольшое количество почвы помещают в фарфоровую чашку и приливают пипеткой несколько капель кислоты. При наличии в почве карбонатов с её поверхности начинают выделяться пузырьки углекислого газа. По интенсивности их выделения судят о более или менее значительном содержании карбонатов.

Описание опыта 1

А) Заполним примерно половину объёма пробирки исследуемым образцом почвы;

Б) Оставшийся, свободный объём пробирки заполнить водой;

В) Пробирку плотно закрыть крышкой;

Г) Перемешали содержимое пробирки, интенсивно встряхивая пробирку в течении 5 минут;

Д) Ждем полного осаждения взвеси почвы на дно пробирки;

Е) Опустили индикаторную бумагу в почвенную вытяжку;

Ё) Сравнили окрашивание индикаторной бумаги со шкалой, приведенной на рисунке ниже и зафиксировать приблизительное значение pH для исследуемой вытяжки в лабораторном журнале.

Описание опыта 2

Нальём в стакан 20-30 мл воды BonAqua ;

Погрузим тест-полоску в воду BonAqua 2-3 секунды ;

Извлечем тест-полоску и удалим избыток воды стряхивающим движением;

Положим тест-полоску на белую бумагу и дождёмся проявление окраски;

Сравним цвет полоски со шкалой на рисунке ниже. По приведенной шкале оцените содержание нитратов в воде BonAqua в мг/мл. Оставьте тест-полоску для сравнения ей цвета с результатами окрашивания тест полоски в почвенной вытяжке;

Определение содержания нитратов в почвенной вытяжке:

На весах подготовить навеску влажной почвы массой 30 г;

Перенесём навеску почвы в колбу и добавим 100 мл воды BonAqua

Колбу закройте крышкой и перемешайте её содержимое взбалтыванием;

Оставим содержимое колбы при комнатной температуре на 20-30 минут для перехода нитрат-ионов из почвы в раствор;

Сложим из бумаги фильтр и разместим его в воронке;

Отфильтруем почву от почвенной вытяжки с помощью воронки с фильтром;

Погрузим тест-полоску в полученную почвенную вытяжку на 2-3 секунды (в воду должен погружаться кончик с утолщением);

Извлечем тест-полоску и удалим избыток воды стряхивающим движением;

Положим тест-полоску на белую бумагу и дождёмся проявления окраски;

Сравним цвет полоски со шкалой на рисунке выше и с результатами окрашивания полоски BonAqua. Приложение 1 Фото 5.

Результаты и наблюдения

2.3. Опыт №3 «Изучение почвенного дыхания»

«Дыхание почвы» - процесс образования CO2 в результате разложения и окисления органического вещества почвенными микроорганизмами и корнями растений.

Подготовка к эксперименту

Подготовим 3 одинаковые емкости объёмом 0.5 и 1 л с герметично закрывающейся крышкой;

Промаркируем емкости номерами 1, 2 и 3 с помощью перманентного маркера;

Взвесим и зафиксируем их массу в лабораторном журнале;

На весах подготовим две одинаковые навески почвы, масса навески должна составить 150 г, если сухую – 100г;

Перенесём навески почвы в емкости №2 и №3;

Распределим почву ровным слоем по дну емкостей;

Подготовим и пронумеруем с помощью перманентного маркера 3 емкости для титрования;

Возьмём пипетку на 5 мл и подпишем её «NaOH»;

С помощью пипетки на 5 мл перенесите в каждую ёмкость для титрования по 10 мл раствора NaOH 0,1 M;

Поставим открытие емкости для титрования №2 и №3 с раствором NaOH на поверхность почвы в соответствующих емкостях на 0,5-1 л №2 и №3;

Открытую емкость для титрования №1 с раствором NaOH поместите на дно;

Закроем емкости крышкой и оставьте на сутки при комнатной температуре; (таблица 3).

-Титрование

Извлечем вторую пипетку на 5 мл из упаковки и подпишем на её верхней части «HCl»;

Откроем капельницу, извлечем носик-дозатор и перенесём в неё с помощью пипетки 15 мл раствора HCl 0,1 M;

Вставим носик-дозатор в капельницу;

Извлечём из ёмкости №1 емкость с раствором NaOH 0,1 M;

Добавим в раствор 1 каплю фенолфталеина;

Разместим ёмкость для титрования на белой бумаге и, считая количество капель добавляем и перемешивая содержимое емкости вращательными движениями добавим в ёмкость для титрования HCl из капельницы до полного обесцвечивания раствора;

Зафиксируем количество капель HCl, которое потребовалось для полного обесцвечивания раствора;

Рассчитаем объём HCl, который потребовался для нейтрализации щелочи по формуле: VHCL = Nкапель *Vкапли, где Nкапель – число капель ,

которое потребовалось для титрования Vкапли – объём одной капли в мл, Vкапли = 0,04мл;

Вычислим количество моль щелочи, содержащееся в емкости для титрования по формуле: n(NaOH)ср = СHCL*VHCl=0,1*VHCl, где VHCl – объём HCl в литрах, потраченный на титрование;

Аналогично проведём титрование растворов NaOH 0,1 из емкостей №2 и №3 и рассчитаем количество моль щелочи, содержащееся в них:

Рассчитаем среднее количество моль щелочи, содержащиеся в них:

Сравните количество в емкости №1 со средним количеством моль щелочи в емкостях №2 и №3;

Вычислим массу CO2, выделившегося в результате дыхания почвы по формуле: m(CO2) = (n(NaOH)1 – n(NaOH)ср)*M(CO2), где n(NaOH)1 – количество NaOH, содержащееся в емкостях №2 и №3, M(CO2) = 44г/моль- молярная масса CO2.

Результаты и наблюдения: При проверке почвы на дыхание в темноте, с 20 по 23 числа, при титровании образца 1 раствор при добавлении кислоты цвет не изменил (40 капель); в образце 2 осталась также без изменений, цвет не изменился даже при добавлении 130 капель кислоты; аналогично с образцом 3: при добавлении 130 капель кислоты образец цвет не поменял.

Вывод: Скорее всего, в данном образце почвы находились живые организмы, за счёт чего, в почве кислород не поглощался, а наоборот, выделялся, соответственно углекислого газа в почве было очень мало, и поэтому обесцвечивание раствора не происходило.

(приложение 1 фото 6,7).

2.4. Опыт № 4 «Посев и наблюдение за ростом колоний бактерий AZOTOBACTER»

- Подготовительный этап

Взяли белый лист бумаги и обвели на нем контур чашки Петри;

Нарисуйте в контуре чашки Петри трафарет;

-Приготовления вспомогательного раствора

В мерную колбу объёмом 1 литр нальём 300-400 мл воды;

Высыпем в колбу с водой всё содержимое флаконов с NaCl, K2SO4,

MgSO4*7H2 O и K2HPO4 и перемешайте смесь;

Доведём объём раствора до отметки 1 литр и проконтролируем, что все соли полностью растворились;

-Подготовка среды Эшби

На весах подготовьте навески;

1.а) 1 г CaCO3

1.б) 3 г Агара

1.в) 4г глюкозы

В химический стакан налили 200 мл вспомогательного раствора;

В стакан с раствором перенесли навески CaCO3, Агара и глюкозы;

Смесь в стакане перемешали до состояния однородной взвеси;

Смесь вскипятили на плите или в микроволновой печи до максимального растворения компонентов;

Смесь охладили до 50-60 0C и заполните ей чашки Петри так, что бы смесь полностью покрывала дно;

-Подготовка почвы для анализа

Образцы почвы высушили, убрали крупные остатки растительности, камни, мусор;

Перенесём 3 грамма почвы в пустую чашку Петри или любую другую емкость с бортиком;

К почве с помощью пипетки по каплям добавили дистиллированную воду до получения пастообразной массы;

Увлажненную почву тщательно перемешать с помощью зубочистки;

-Посев

Из увлажненной почвы отделить 40-50 комочков диаметром 3-4мм;

Чашку Петри, застывшей средой, разместить на трафарете, совместив чашки с контуром трафарета;

В чашке Петри в узлах трафарета, разместите подготовленные комочки земли;

Чашки Петри накрыть крышками и оставить на 3-4 дня при комнатной температуре (приложение фото 3)

Результаты и наблюдения: Колонии имеют округлую форму, прозрачные. (10.06); (13.06) Колонии проросли, все имеют светлый оттенок (0.8-0.9, остальные от 0.5 (41 колония)), края ровные, округлые.

Вывод: Активность образцов (см приложение фото 5).

2.5. Опыт №5 «Микроскопическое исследование образцов»

Протрём предметное стекло спиртовой салфеткой для удаления загрязнений и жирового слоя;

В чашках Петри, засеянных 6-7 дней назад, выберем несколько колоний с разной окраской;

В лабораторном журнале схематично отобразим чашку Петри с трафаретом внутри;

Отберём пробу от заинтересовавших нас колоний для микроскопического исследования: с помощью зубочистки отберём небольшое количество биомассы;

Отобранный образец колоний перенесём на предметное стекло: размажем по центральной части предметного стекла биомассу с поверхности зубочистки.

На схеме в лабораторном журнале отобразим, в котором мы взяли исследуемый образец. (Образцу присвоен номер)

С помощью пипетки Пастера на предметное стекло в центр площади, покрытой образцом, нанесём каплю фуксина Циля;

В тоже место, что и фуксин Циля, с помощью пипетки, нанесём каплю туши;

Зубочисткой перемешаем красители и биомассу, находящиеся на стекле, до равномерного слоя грязно-розового цвета;

Получившийся препарат высушим на воздухе;

На препарат нанесём каплю воды и изучим полученный препарат с помощью микроскопа при увеличении x100  (приложение 1 фото 6)

Результаты и наблюдения: Микроскопическое исследование показало, что во всех изучаемых колониях обнаружены  формы клеток - сферической. Цисты- пузыря, защитной оболочки вокруг клеток. 

Выводы:  Можно предположить,  что изученные клетки  относятся к семейству Azotobacteriace относятся бактерии рода Beijerinckia, близкие по свойствам к азотобактеру. Клетки Beijerinckia имеют различную форму — палочковидную, овальную или круглую. У некоторых видов они подвижны, у других неподвижны. Иногда наблюдается образование капсул. Цисты и эндоспоры отсутствуют. Большинство культур бактерий рода Beijerinckia дают на безазотной среде с глюкозой выпуклые, блестящие, нередко складчатые слизистые колонии вязкой консистенции. При старении колонии окрашиваются в красноватый или темно-коричневый цвет. Приложение 1 фото 8.9.

2.6. Опыт № 6 «Исследование бактерий Azotobacter, выделенных из городской почвы, на жизнестойкость при введении в минерализованную почву»

Далее, для продолжения исследования, было решено внести в образец №5 дополнительное питание в виде подслащённой воды. В течение десяти дней я наблюдала за данным образцом и получила следующие результаты:

Результаты и наблюдения: В результате добавления подслащённой воды, активность бактерий возросла: они выходят из цист и скорость их размножения увеличивается, также изменяется окраска колоний.

Вывод: В результате ряда опытов по внесению штаммов бактерий Azotobater в минерализованную почву с целью повышения ее плодородия было выяснено, что прямое внесение, без дополнительного питания бактерий, неэффективно, а внесение бактерий с дополнительным питанием для них — способствует их размножению и активности. Приложение 1 фото 10

Общий вывод по всем исследованиям согласно гипотезе.

Исследование механического состава почвы показало, что образец является тяжелосуглинистом типом. В образце отсутствуют карбонаты, кислотность среды равна 6. Скорее всего, в данном образце почвы находились живые организмы, за счёт чего, в почве кислород не поглощался, а наоборот, выделялся, соответственно углекислого газа в почве было очень мало, и поэтому обесцвечивание раствора не происходило. Изученные клетки  относятся к семейству Azotobacteriace, бактерии рода Beijerinckia, близкие по свойствам к азотобактеру. Клетки Beijerinckia имеют различную форму — палочковидную, овальную или круглую. У некоторых видов они подвижны, у других неподвижны. Иногда наблюдается образование капсул. Цисты и эндоспоры отсутствуют. Большинство культур бактерий Azotobacteriace, рода Beijerinckia дают на безазотной среде с глюкозой выпуклые, блестящие, нередко складчатые слизистые колонии вязкой консистенции. При старении колонии окрашиваются в красноватый или темно-коричневый цвет. В результате ряда опытов по внесению штаммов бактерий Azotobater в минерализованную почву с целью повышения ее плодородия было выяснено, что прямое внесение, без дополнительного питания бактерий, неэффективно, а внесение бактерий с дополнительным питанием для них — способствует их размножению и активности.

Заключение

Мы стали соавторами атласа «Всероссийский атлас почвенных микроорганизмов», работая совместно с Новосибирским институтом почвоведения. Данный проект позволил нам провести ряд интереснейших опытов, при проведении которых мы смогли почувствовать себя настоящими исследователями. По окончании наших исследований, после защиты проекта, нам были выданы сертификаты соавторов.

Тема проекта была выбрана исходя и того, что бактерии рода Azotobacter имеют широкий спектр применения: медицина, сельское хозяйство, косметология, фармакология. Но необходимо учитывать, что Azotobacter не до конца изучены и постоянно появляются новые штаммы, поэтому данная тема остаётся актуальной и по сей день. Надеемся, что наши преемники продолжат начатое нами исследование и успешно его завершат.

Литература

Мишустин Е.Н.,Емцев В.Т. "Микробиология" Агропромиздат. 

Энциклопедия «Жизнь растений» Жуковский П.И 1974

Биологический энциклопедический словарь Гиляров М.С 1989

Методические материалы «Охотники за бактериями»

http://bio.niv.ru/doc/encyclopedia/life-of-plants/articles/5/azotobakter-azotobacter.htm - сведения об азотобактере

Приложение 1

Таблица 1. Морфология колоний Azotobacter

Таблица 2 . Сводная информация исследованных проб почв.

Фото 2. Проба почвы, образец 2.

Фото 1. Проба почвы, образец 1.

Фото 3. Проба почвы , образец 3. Фото 4. Изучение механического

состава почвы.

Фото 5. Анализ рH вытяжки почвы. Фото 6. Проверка дыхания.

Фото 7,8 Посев колоний.

.

Фото 9. Питательная среда. Фото 10.

Фото 11. Фото 12.

Фото 10,11,12 . Фотографии азотобактера.

Фото 14. Отбор образцов азотобактера.